Porownanie metod dezintegracji komorek, Studia - inżynieria & ochrona środowiska (inż. mgr.), Technologie wody ...
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Wydział Chemiczny Politechniki Gdaıskiej
Katedra Technologii Leków i Biochemii
Biologia Komórki - laboratorium
PORÓWNANIE METOD DEZINTEGRACJI KOMÓREK
WST
Ħ
P
Aby wyizolowaę białka otrzymane np. w systemach nadekspresji w komórkach
drobnoustrojów potrzebne sĢ odpowiednie metody, które pozwalajĢ na uwolnienie
danego białka z komórki z duŇĢ wydajnoĻciĢ przy jednoczesnym zachowaniu jego
własnoĻci np. aktywnoĻci enzymatycznej, struktury itp. Szczególnie pleĻnie i droŇdŇe
ale równieŇ komórki roĻlinne posiadajĢ odpornĢ na lizħ Ļcianħ komórkowĢ, która
utrudnia izolacjħ białek i innych składników komórkowych.
Typowa procedura izolacji białek z komórki składa siħ z nastħpujĢcych etapów:
przemycia masy komórkowej (z pozostałoĻci poŇywki lub innych komórek w przypadku
tkanek np. krwi), liza komórek (w celu uwolnienia frakcji cytozolowej komórek) i
oddzielenie frakcji komórkowych od siebie (rozdział frakcji błon komórkowych,
rozpuszczalnych białek i frakcji nierozpuszczalnej). Do rozdziału tych frakcji uŇywa siħ
metod sedymentacyjnych w wirówkach. Ekstrakt komórkowy otrzymany po lizie
komórek nazywamy
homogenatem
. Po oddzieleniu np. składników nierozpuszczalnych
przez wirowanie (zwykle od 10 min. przy 15.000 g do 1 godziny przy 100.000 g)
otrzymuje siħ nadsĢcz (
surowy ekstrakt
) i osad zawierajĢcy frakcjħ błon
komórkowych. NadsĢcz moŇe byę dalej oczyszczany i zawarte w nim białka rozdzielane
np. na kolumnach chromatograficznych w zaleŇnoĻci od specyficznych własnoĻci
interesujĢcego nas białka (ciħŇar czĢsteczkowy, punkt izoelektryczny, wiĢzanie siħ z
innymi substancjami itp.)
NajwaŇniejszym z punktu widzenia wydajnoĻci procesu izolacji białek jest etap
dezintegracji komórek. RóŇne sposoby lizy róŇnych rodzajów komórek i tkanek podane
sĢ w Tabeli 1.
Homogenizacja.
Jest to jedna z najczħĻciej uŇywanych metod do dezintegracji miħkkich tkanek
zwierzħcych. W zaleŇnoĻci od rodzaju tkanki uŇywa siħ róŇnych typów
homogenizatorów: Potter-Elvehjema (tkanki wĢtroby, serca, mózgu, miħĻni gładkich),
Dounce'a (tkanka mózgu, komórki z hodowli tkankowych), homogenizatora-miksera
(Rys. 1). W czasie homogenizacji utrzymuje siħ obniŇonĢ temperaturħ (0-4
o
C) i dodatek
inhibitorów proteaz komórkowych. Postħp procesu moŇna monitorowaę przez
obserwacje mikroskopowe lub przez pomiar uwolnionego białka komórkowego w
nadsĢczu.
Sonifikacja.
Metoda uŇywana do dezintegracji bakterii np.
Escherichia. coli
,
Bacillus subtilis
,
Klebsiella pneumoniae
i komórek zwierzħcych np. mózgu. W metodzie tej wykorzystuje
siħ wibracje tzw. fale kawitacji wywoływane w roztworze przez ultradŅwiħki, które
mechanicznie uszkadzajĢ Ļcianħ komórkowĢ. WielkoĻę wibracji musi byę utrzymywana
na takim poziomie aby nie powodowaę tworzenia siħ piany poniewaŇ wywołuje to
natlenienie roztworu co z kolei moŇe prowadzię do denaturacji białek. Sonifikator składa
siħ z sondy i układu elektronicznego kontrolujĢcego poziom ultradŅwiħków (patrz Rys.
2). Jednym z ograniczeı metody jest iloĻę komórek, która nie moŇe przekroczyę ok 1 g
na cykl. W czasie sonifikacji konieczne jest równieŇ chłodzenie zawiesiny komórek
przez np. zanurzenie naczynia w mieszaninie woda-lód.
Tabela 1. Metody dezintegracji komórek (tkanek).
metoda rodzaj komórek (tkanki)
________________________________________________________________________________________________
krojenie
wiħkszoĻę tkanek roĻlinnych
i zwierzħcych
homogenizacja
(Dounce'a, Potter-Elvehjem'a) miħkkie tkanki zwierzħce
sonifikacja (ultradŅwiħki)
zawiesiny komórek
Prasa French’a
bakterie, droŇdŇe, komórki roĻlinne
rozcieranie
bakterie, tkanki roĻlinne
wytrzĢsanie
z kulkami szklanymi
zawiesiny komórek
trawienie enzymatyczne
bakterie, droŇdŇe
liza detergentami
komórki z hodowli tkankowej
liza rozpuszczalnikami
organicznymi
bakterie, droŇdŇe
szok osmotyczny
krwinki (erytrocyty), bakterie
zamraŇanie/rozmraŇanie wiħkszoĻę rodzajów komórek
________________________________________________________________________________________________
Prasa French’a (French Pressure Cell).
Metoda polega na poddaniu zawiesiny komórek wysokiemu ciĻnieniu i gwałtownym
uwolnieniu do ciĻnienia atmosferycznego w specjalnym typie prasy (Rys. 3). Zmiana
ciĻnienia powoduje rozpad komórek. Metoda pozwala na dezintegracjħ z wysokĢ
wydajnoĻciĢ zawiesin komórek o objħtoĻci ok. 10-30 ml ale staje siħ technicznie trudna
dla mniejszych objħtoĻci i zbyt czasochłonna dla objħtoĻci wiħkszych. UŇywana jest
najczħĻciej do dezintegracji komórek bakteryjnych i droŇdŇowych.
Rozcieranie.
Tak jak dezintegracja w Prasie Francuskiej ucieranie z substancjami Ļciernymi uŇywane
jest do rozbijania komórek organizmów jednokomórkowych. UŇywane materiały i sprzħt
sĢ niekosztowne (moŅdzierz, piasek lub obojħtny tlenek glinu) a metoda pozwala na
dezintegracjħ masy komórek do ok. 30 g na cykl.
Wytrz
Ģ
sanie z kulkami szklanymi.
Jest ulepszeniem metody ucierania. Mechaniczne uszkadzanie Ļciany komórkowej
powodujĢ małe kulki szklane wytrzĢsane w zawiesinie komórek. Metoda ta uŇywana
jest równieŇ w stosunku do organizmów jednokomórkowych, najczħĻciej droŇdŇy. W
małej skali (ok. 1 g masy komórek) prowadzi siħ jĢ w naczyniach laboratoryjnych np.
probówkach, przy duŇych objħtoĻciach zawiesiny komórek wymaga uŇycia specjalnej
aparatury (patrz np. aparat przedstawiony na Rys. 4).
Trawienie enzymatyczne.
Polega na degradacji składników Ļciany komórkowej i otrzymaniu komórek
pozbawionych Ļciany komórkowej tzw. protoplastów, które łatwo poddaę lizie przez np.
szok osmotyczny. W przypadku bakterii uŇywa siħ lizozymu trawiĢcego bakteryjne
peptydoglikany, u droŇdŇy uŇywana jest zymoliaza (glukanaza), enzym trawiĢcy glukan
bħdĢcy głównym składnikiem Ļciany komórkowej droŇdŇy.
Liza detergentami.
Metoda ta jest czħsto uŇywana do dezintegracji komórek utrzymywanych w hodowli
tkankowej. Jest bardzo zachowawcza jeĻli chodzi o własnoĻci izolowanych białek jeĻli
tylko stħŇenie detergentu potrzebnego do lizy komórek jest niewysokie. NajczħĻciej
uŇywane detergenty to: Triton X-100, NP-40, dodecylan sodowy, siarczan sarkozylu,
deoksycholan sodowy i inne.
Liza rozpuszczalnikami organicznymi.
Metoda uŇywana do rozbijania komórek bakterii choę ograniczona głównie do lizy
komórek na sĢczkach, które majĢ byę nastħpnie inkubowane z przeciwciałami lub
sondami DNA.
Szok osmotyczny.
Komórki sĢ wraŇliwe na szok osmotyczny gdy przetrzymywane sĢ w roztworach
hypotonicznych (o ciĻnieniu osmotycznym mniejszym niŇ w cytoplazmie). Metodħ
stosuje siħ do lizy czerwonych komórek krwi (erytrocytów) i komórek pozbawionych
Ļciany komórkowej np. protoplastów bakterii czy droŇdŇy.
Zamra
Ň
anie/rozmra
Ň
anie.
Wzrost objħtoĻci zamarzajĢcej w cytoplazmie wody oraz powstajĢce kryształy lodu
powodujĢ uszkadzanie Ļciany i błony komórkowej oraz organelli komórkowych. Metodħ
stosuje siħ podczas izolacji odpornych na denaturacjħ białek poniewaŇ zamarzanie
powodujħ czħĻciowĢ utratħ wody hydratacyjnej białek co prowadzi do zmian ich
własnoĻci (denaturacja). Ograniczeniem jest równieŇ koniecznoĻę ochrony białek przed
działaniem uwolnionych, głównie z lizosomów, enzymów proteolitycznych.
LITERATURA
Fleicher, S., J.O. McIntyre, and J.C. Vital. 1979. Methods in Enzymology. 55: 32-39.
Large scale preparation of rat liver mitochondria in high yield.
Harlow, E., and D. Lane. 1988. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Bollag, D.H. and S.J. Edelstein. 1992. Protein Methods. Wiley&Liss, New York.
Rys. 3. Prasa French’a
WYKONANIE
Ę
WICZENIA
- Porównanie metod dezintegracji komórek
Materiały:
−
DroŇdŇe piekarnicze (
Saccharomyces cerevisiae
)
−
Izotoniczny roztwór chlorku sodu buforowany fosforanami (PBS)
−
Odczynniki do oznaczania białka metodĢ Bradford
−
Standardowy roztwór albuminy wołowej (BSA) o stħŇeniu 10 mg/ml
−
0.5% roztwór SDS (dodecylosiarczan sodu) w PBS
Sprz
ħ
t:
−
Probówki 15 ml oraz 50 ml z polipropylenu typu FALCON, statywy
−
Probówki 1.5 ml typu Eppendorf
−
Pipety automatyczne 200
µ
l, 1000
µ
l, 5000
µ
l, koıcówki do pipet
−
Tryskawka z etanolem i wodĢ destylowanĢ
−
Zlewki, lignina
−
WytrzĢsarka laboratoryjna (vortex)
−
Spektrofotometr, kuwety
−
Prasa French'a
−
Kulki szklane o Ļrednicy 1-2 mm
−
MoŅdzierz, obojħtny tlenek glinu
Metoda z rozcieraniem:
OdwaŇyę 1 g mokrej masy droŇdŇy, przenieĻę do moŅdzierza, dodaę 1 ml roztworu PBS
i dodawaę stopniowo 2 g obojħtnego tlenku glinu rozcierajĢc masħ komórek. Rozcieraę
masħ do uzyskania jednolitej kleistej masy (przez ok 15-20 min.), dodaę 4 ml PBSu i
dokładnie wymieszaę. PrzenieĻę zawiesinħ do 15 ml probówki, przepłukaę dokładnie
moŅdzierz 5 ml PBSu i przenieĻę do probówki (koıcowa objħtoĻę zawiesiny komórkowej
powinna wynosię 10 ml). Zawiesinħ komórek odwirowaę przy 3000 rpm przez 10 min.
Klarowny nadsĢcz zachowaę do oznaczenia stħŇenia białka.
Metoda z u
Ň
yciem szklanych kulek:
OdwaŇyę 1 g mokrej masy droŇdŇy, przenieĻę do 50 ml probówki zawierajĢcej 8 g
szklanych kulek o Ļrednicy 2 mm. Dodaę do probówki 10 ml PBS, wytrzĢsaę na
wytrzĢsarce (vortex) przez 20-30 min przy maksymalnych obrotach. Po dezintegracji,
zawiesinħ komórek przenieĻę pipetĢ do 15 ml probówki (pozostawiajĢc szklane kulki w
probówce 50 ml), odwirowaę przy 3000 rpm przez 10 min. Klarowny nadsĢcz zachowaę
do oznaczenia stħŇenia białka.
Metoda z u
Ň
yciem Prasy French’a:
OdwaŇyę 1 g mokrej masy droŇdŇy, przenieĻę do 15 ml probówki i dodaę 10 ml PBS.
Dokładnie wymieszaę do uzyskania jednolitej zawiesiny komórek. PrzenieĻę zawiesinħ
do Prasy French’a i rozbię komórki. Po dezintegracji, zawiesinħ komórek przenieĻę do
15 ml probówki, odwirowaę przy 3000 rpm przez 10 min. Klarowny nadsĢcz zachowaę
do oznaczenia stħŇenia białka.
[ Pobierz całość w formacie PDF ]