Podstawowe parametry opisujace uklad chromatograficzny, Chemia analityczna
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Podstawowe parametry opisujace uklad.qxp 2004-06-15 23:16 Page 7
1. PODSTAWOWE PARAMETRY OPISUJ¥CE UK£AD
CHROMATOGRAFICZNY
Bogumi³a Makuch, Marian Kamiñski
Chromatografia jest technik¹ rozdzielania mieszanin substancji w uk³adzie dwufazowym
(faza stacjonarna / faza ruchoma). Jest przydatna do rozdzielania substancji, które mo¿na rozpu-
œciæ w jakimkolwiek rozpuszczalniku, pod warunkiem, ¿e istnieje minimalna chocia¿ roz-
puszczalnoœæ w eluencie. Proces chromatograficzny mo¿na zdefiniowaæ jako zespó³ oddzia³y-
wañ faz z substancjami obecnymi w mieszaninie, który prowadzi do rozdzielenia substancji i do
opuszczania kolumny przez poszczególne sk³adniki mieszaniny w ró¿nym czasie. Mówi¹c œciœle
i w zgodzie z zasadami fizykochemii - proces chromatograficzny prowadzi do opuszczania
kolumny przez poszczególne sk³adniki mieszaniny rozdzielanych substancji, z ró¿nymi wartoœ-
ciami objêtoœci elucji.
Wyniki rozdzielania zapisywane s¹ w formie pików chromatograficznych, których kszta³t
(rozk³ad stê¿enia) odpowiada pasmu stê¿eniowemu substancji opuszczaj¹cej kolumnê chro-
matograficzn¹, a zapis ten nosi nazwê chromatogramu.
Chromatogram mo¿e byæ Ÿród³em informacji dwojakiego typu:
- jakoœciowych - na podstawie miejsca piku na chromatogramie mo¿na m.in. wnioskowaæ o
rodzaju (w³aœciwoœciach fizykochemicznych) rozdzielanych substancji, a na podstawie licz-
by pików, o liczbie sk³adników w mieszaninie (jednak¿e pod warunkiem, ¿e zastosowany
uk³ad chromatograficzny zapewni³ rozdzielenie wszystkich sk³adników mieszaniny a detek-
tor jest czu³y na wszystkie sybstancje - wszystkie je “widzi”);
- iloœciowych - wielkoœæ rejestrowanego sygna³u detektora, mierzona wysokoœci¹, albo
powierzchni¹ piku chromatograficznego jest funkcj¹ stê¿enia b¹dŸ masy substancji w próbce
dozowanej do kolumny.
Na rysunku 1.1 przedstawiono schemat klasycznej kolumny chromatograficznej oraz
wynik procesu rozdzielania w kolumnie, tzn. chromatogram.
Proces chromatograficzny to wielokrotna sorpcja i desorpcja substancji z fazy stacjonarnej
do fazy ruchomej i odwrotnie, z fazy ruchomej do stacjonarnej. W zale¿noœci od “si³y” oddzia³y-
wañ z ka¿d¹ z faz, sk³adniki mieszaniny szybciej lub wolniej przemieszczaj¹ siê wzd³u¿ warst-
wy wype³nienia i opuszczaj¹ kolumnê w ró¿nym czasie. Jednoczeœnie pasma ulegaj¹ poszerze-
niu (rozmyciu) na skutek procesów dyfuzyjnych i dyspersyjnych oraz w rezultacie ograniczonej
szybkoœci zjawisk sorpcji-desorpcji.
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
7
Podstawowe parametry opisujace uklad.qxp 2004-06-15 23:16 Page 8
Podstawowe parametry opisuj¹ce uk³ad chromatograficzny
Rys. 1.1. Schemat kolumny chromatograficznej i chromatogram rozdzielonej mieszaniny.
Ze wzglêdu na ró¿ny mechanizm oddzia³ywañ rozdzielanych substancji z faz¹ ruchom¹ i
stacjonarn¹ uk³ady chromatograficzne dzieli siê na:
1. Adsorpcyjne (ciecz - cia³o sta³e) w uk³adzie faz normalnych (NP), gdy wykorzystuje siê
interakcje polarnych grup funkcyjnych rozdzielanych sk³adników z polarnymi centrami akty-
wnymi, obecnymi na powierzchni fazy stacjonarnej. Przeciwnym do tego uk³adu jest tzw.
uk³ad faz odwróconych ( RP), gdy faza stacjonarna jest niepolarna a faza ruchoma polarna,
a retencja i rozdzielanie substancji jest zale¿ne od stopnia hydrofobowoœci moleku³. Do tej
grupy nale¿y te¿ zaliczyæ tzw. chromatografiê oddzia³ywañ hydrofobowych (HIC), gdy do
rozdzielania wykorzystuje siê hydrofobowe oddzia³ywania makromoleku³ z hydrofobow¹
powierzchni¹ fazy stacjonarnej, wzmacniane w warunkach zbli¿onych do warunków tzw.
wysalania.
2. Podzia³owe (ciecz-ciecz), w których o rozdzielaniu decyduje ró¿nica wspó³czynników po-
dzia³u sk³adników mieszaniny miêdzy dwie fazy ciek³e, tzn. miêdzy ciek³¹ fazê ruchom¹ i
8
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
Podstawowe parametry opisujace uklad.qxp 2004-06-15 23:16 Page 9
Podstawowe parametry opisuj¹ce uk³ad chromatograficzny
ciek³¹ fazê stacjonarn¹ - osadzon¹ statycznie na noœniku, b¹dŸ generowan¹ w sposób dyna-
miczny w czasie przep³ywu eluentu przez kolumnê.
3. Jonowymienne (zwane, w ich nowoczesnej realizacji - jonowymi), gdy rozdzielanie
mieszaniny jest oparte na odwracalnej wymianie jonów z faz¹ stacjonarn¹. Do tej grupy
nale¿y te¿ zaliczaæ tzw. chromatografiê wykluczania jonowego, gdy mechanizm rozdzielania
nie jest œciœle jonowymienny i wykorzstuje siê zjawisko powstawania tzw. membrany
Donnana.
4. Chromatografiê par jonowych - alternatywa dla chromatografii jonowymiennej, wykorzysty-
wana g³ównie w uk³adach faz odwróconych, gdy jonowe, albo bardzo silnie polarne frag-
menty cz¹steczek substancji rozdzielanych s¹ “maskowane” odpowiednim organicznym
“przeciwjonem” i powstaje kompleks, który zachowuje siê w uk³adzie chromatograficznym
podobnie jak substancja neutralna.
5. Chromatografiê ¿elow¹, nazywan¹ chromatografi¹ “wykluczania sterycznego” lub sitow¹,
stosowan¹ do rozdzielania substancji o ró¿nej masie molowej (w zakresie do ok. 10 000 000
Da) - wykorzystuje siê mechanizm tzw. “sita molekularnego”, czy tzw. “wykluczania
sterycznego” - eliminuj¹c, na ile to mo¿liwe, zjawiska sorpcji.
6. Chromatografiê powinowactwa, - stosowan¹ w biochemii i w biotechnologii, gdy wykorzy-
stuje siê specyficzne reakcje chemiczne (np. oddzia³ywanie enzym - koenzym), albo innego
typu specyficzne oddzia³ywania miêdzy faz¹ stacjonarn¹ a substancjami rozdzielanymi (np.
tzw. chromatografia “metalopowinowactwa” - oddzia³ywania Ni...S). Chromatografiê
powinowactwa mo¿na te¿ stosowaæ bez kolumny, wykonuj¹c rozdzielenie w naczyniu labo-
ratoryjnym, albo bezpoœrednio w bioreaktorze.
Uk³ady chromatograficzne mo¿na opisaæ liczbowo. Opis taki dotyczy, g³ównie:
A - parametrów fizycznych kolumny,
B - selektywnoœci uk³adu chromatograficznego,
C - sprawnoœci uk³adu,
Ad A
- G³ówne fizyczne parametry kolumny uwzglêdniaj¹ wymiary kolumny tj. d³ugoœæ
(
L
c
), œrednicê wype³nienia kolumny (
d
c
), liniow¹ (
u
) i objêtoœciow¹ (
w
) prêdkoœæ przep³ywu fazy
ruchomej oraz œredni¹ wielkoœæ ziaren wype³nienia (
d
p
). Niekiedy, podawany jest, dodatkowo,
zakres wielkoœci ziaren wype³nienia (najczêœciej od 10% do 90% udzia³u masowego na krzywej
rozk³adu granulometrycznego). Parametrami kolumny s¹ te¿: objêtoœæ martwa (
V
0
) i z ni¹
zwi¹zany - czas martwy kolumny (
t
0
). Objêtoœæ martwa kolumny zale¿y od wymiarów kolumny
oraz od rodzaju i stopnia upakowania wype³nienia. Tzn., od porowatoœci ca³kowitej, a st¹d wiêc,
od porowatoœci miêdzy-ziarnowej i wewn¹trz-ziarnowej w przypadku tzw. kolumn pakowanych
oraz od porowatoœci makro- i mezo-porów oraz mikroporów, w przypadku tzw. kolumn “mono-
litycznych), ale “w pierwszym przybli¿eniu” nie zale¿y od natê¿enia przep³ywu eluentu. Objê-
toœæ martw¹ mo¿na uwa¿aæ za sumê objêtoœci cieczy, która jest “uwiêziona” (unieruchomiona)
w porach oraz tej, która znajduje siê miêdzy ziarnami wype³nienia. Analogicznym parametrem
do objêtoœci martwej kolumny jest czas martwy kolumny (
t
0
), który definiuje siê jako czas od
momentu wprowadzenia do kolumny substancji nie ulegaj¹cej sorpcji, jednak wnikaj¹cej do
wszystkich porów wewn¹trz ziaren wype³nienia, do chwili pojawienia siê maksimum piku tej
substancji na wylocie z kolumny. Czas martwy kolumny zale¿y od objêtoœci martwej kolumny
i od objêtoœciowej prêdkoœci przep³ywu fazy ruchomej (od natê¿enia przep³ywu fazy ruchomej).
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
9
Podstawowe parametry opisujace uklad.qxp 2004-06-15 23:16 Page 10
Podstawowe parametry opisuj¹ce uk³ad chromatograficzny
Wzajemn¹ zale¿noœæ tych parametrów wyra¿a równanie:
t
0
=
V
0
(1)
w
gdzie:
w
- objêtoœciowa prêdkoœæ przep³ywu fazy ruchomej,
w przybli¿eniu:
V
=
0
6
d
c
L
⋅
(2)
0
c
gdzie:
L
c
- d³ugoœæ kolumny,
d
c
- œrednica wewnêtrzna kolumny.
Równanie (2) jest s³uszne, gdy ca³kowita porowatoœæ wype³nienia wynosi oko³o 0,76.
Wyznaczenie objêtoœci martwej kolumny nie jest wcale proste. Dane literaturowe wskazu-
j¹, ¿e ró¿nice oznaczonych eksperymentalnie wartoœci, siêgaj¹ +/-20% i otrzymana wartoœæ
zale¿y od warunków wyznaczania tego wa¿nego parametru kolumny, a przy bardzo dok³adnej
obserwacji, tak¿e od natê¿enia przep³ywu eluentu.
Najczêœciej czas martwy (objêtoœæ martw¹ kolumny) w uk³adach faz normalnych (NP),
wyznacza siê, stosuj¹c skwalan, albo fluoroalkany, jako substancjê wzorcow¹, a faz¹ ruchom¹
jest rozpuszczalnik o œredniej sile elucyjnej np. octan etylu. W uk³adach faz odwróconych stosu-
je siê czêsto uracil lub D
2
O lub stê¿ony roztwór azotanu potasu (detekcjê przy d³ugoœci fali
λ=205-210 nm), jako substancjê testow¹, a faz¹ ruchom¹ mo¿e byæ metanol albo acetonitryl.
Ad B
- Selektywnoœæ uk³adu chromatograficznego dotyczy dwóch pojêæ tj. selektywnoœ-
ci kolumny (sorbentu) i selektywnoœci fazy ruchomej eluentu. Najproœciej selektywnoœæ uk³adu
chromatograficznego mo¿na okreœliæ odleg³oœci¹ miêdzy maksimum kolejnych pików, przy
za³o¿eniu, ¿e mieszanina jest ca³kowicie rozdzielona. Odleg³oœæ miêdzy maksimami pasm stê¿e-
niowych sk³adników mieszaniny daje pogl¹d o oddzia³ywaniach tych substancji z faz¹
stacjonarn¹ (i faz¹ ruchom¹). Selektywnoœæ uk³adu chromatograficznego jest wiêc miar¹
oddzia³ywañ miêdzycz¹steczkowych. Jest przede wszystkim zale¿na od budowy chemicznej
sk³adników rozdzielanej mieszaniny i od w³aœciwoœci sorbentu i eluentu. Rodzaje oddzia³ywañ
miêdzyfazowych i miêdzycz¹steczkowych oraz mechanizmy retencji bêd¹ szczegó³owo opisane
w kolejnych rozdzia³ach. Liczbowo, selektywnoœæ wyra¿ana jest parametrami retencji,
tj.,
V
R
- objêtoœæ retencji,
t
R
- czas retencji ,
k
- wspó³czynnik retencji.
Wyra¿anie selektywnoœci za pomoc¹ objêtoœci, a szczególnie, za pomoc¹ czasu retencji,
utrudnia porównanie poszczególnych uk³adów chromatograficznych (ró¿ne wymiary kolumny,
ró¿na prêdkoœæ przep³ywu fazy ruchomej powoduje uzyskanie ró¿nych wartoœci czasu, a tak¿e
objêtoœci retencji).
Obiektywnym parametrem pozwalaj¹cym porównaæ selektywnoœæ ró¿nych uk³adów chro-
matograficznych jest bezwymiarowy wspó³czynnik retencji
k
, który wi¹¿e, w odniesieniu do
konkretnej substancji, parametry eluentu i parametry fazy stacjonarnej kolumny.
k
=
K
( )
V
s
/ =
m
C
V
s
/
C
m
V
m
(3)
gdzie:
K
- sta³a podzia³u z równania Nernsta,
V
s
- objêtoœæ fazy stacjonarnej,
V
m
- objêtoœæ fazy ruchomej,
C
m
- stê¿enie substancji w fazie ruchomej,
C
s
- stê¿enie substancji w fazie stacjonarnej.
Nale¿y pamiêtaæ, ¿e nie jest to proste przeniesienie równania Nernsta, gdzie za³o¿ono, ¿e
stosunek objêtoœci fazy organicznej do objêtoœci fazy nieorganicznej jest bliski 1:1.
10
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
2
V
s
Podstawowe parametry opisujace uklad.qxp 2004-06-15 23:16 Page 11
Podstawowe parametry opisuj¹ce uk³ad chromatograficzny
W praktyce wspó³czynnik retencji
k
wyznacza siê z chromatogramu, korzystaj¹c
z poni¿szej zale¿noœci (4), zwanej równaniem elucji.
VV k
=+ =+
0
( )
lub
t t
0
( )
k
(4)
gdzie:
V
R
- objêtoœæ retencji okreœlonej substancji, pozosta³e zmienne j.w.
Kolejnym, szczególnie wa¿nym parametrem, opisuj¹cym selektywnoœæ kolumny jest
α, tzn. - wspó³czynnik selektywnoœci, b¹dŸ retencja wzglêdna, albo wspó³czynnik rozdzielenia.
α=
k
2
/
k
1
(5)
gdzie:
cyfry 1 i 2 odnosz¹ siê do kolejnych pików chromatograficznych, odpowiednio:
nastêpnego i poprzedniego.
Ad C
- Sprawnoœæ uk³adu chromatograficznego jest wyra¿ana liczb¹ pó³ek teoretycznych
(
N
), b¹dŸ tzw. wartoœci¹ wysokoœci równowa¿nej pó³ce teoretycznej, potocznie: “wysokoœci¹
pó³ki teoretycznej” (
H
). Pogl¹dowo wysokoœæ pó³ki teoretycznej mo¿na zdefiniowaæ jako teore-
tyczn¹ wysokoœæ wype³nienia kolumny, w zakresie której, ustala siê stan równowagi stê¿enia
substancji w fazie stacjonarnej i w fazie ruchomej.
W literaturze naukowej mo¿na znaleŸæ szereg teorii i zale¿noœci, wg których mo¿na
teoretycznie okreœliæ sprawnoœæ kolumny chromatograficznej, uwzglêdniaj¹c wielkoœæ ziaren,
strukturê wype³nienia, kinetykê dyfuzji, opory przenoszenia masy, prêdkoœæ i profil przep³ywu
cieczy, kinetykê zjawisk sorpcji - desorpcji itp. W praktyce, liczbê pó³ek teoretycznych mo¿na
³atwo obliczyæ na podstawie chromatogramu, korzystaj¹c z zale¿noœci (6):
N
= 5.545 (
l
R
/
w
1/2
)
2
(6)
gdzie:
w
1/2
- szerokoœæ piku w po³owie wysokoœci (obliczona na podstawie chro-
matogramu).
Obliczenia wykonane na podstawie chromatogramu z zastosowaniem zale¿noœci (6) oraz
innych, uwzglêdniaj¹cych szerokoœæ pików przy linii bazowej i ich odleg³oœæ od punktu dozowa-
nia, s¹ teoretycznie poprawne tylko wtedy, gdy kszta³tu piku jest gaussowski. Otrzymana wartoœæ
(
N
) jest ró¿na dla substancji o ró¿nych wspó³czynnikach retencji. Na ogó³ przyjmuje siê, ¿e
dopuszczalne s¹ ró¿nice o oko³o 15%. Wiêksze ró¿nice s¹ spowodowane nadmiernym wp³ywem
tzw. poza-kolumnowych efektów rozmycia stref substancji, nieregularnym profilem przep³ywu
cieczy w kolumnie, albo / i wyraŸnie nieliniowymi zjawiskami sorpcji w kolumnie.
W przypadku pików niesymetrycznych, do obliczania sprawnoœci kolumny stosuje siê
równanie Dorsey-Foley'a, które opisuje zale¿noœæ (7)
( )
( )
l w
2
N
=
R
0,1
(7)
BA
+
1, 25
gdzie:
w
0,1
- szerokoœæ piku na wysokoœci 10 % powy¿ej podstawy piku (powy¿ej
linii bazowej),
CHROMATOGRAFIA CIECZOWA
11
1
1
R
R
l
R
,
- odleg³oœæ maksimum piku od punktu dozowania;
41, 7 /
/
[ Pobierz całość w formacie PDF ]