Podstawy%20chromatografi%20gazowej%20Cz VII Analiza ilosciowa, WIiTCh PK, Chemia analityczna
[ Pobierz całość w formacie PDF ]
Chemia Analityczna
Chromatografia
Tłumaczyła: inż. Karolina Hierasimczyk
Korekta:
dr hab. inż. Waldemar Wardencki, prof. nadzw. PG
prof. dr hab. inż. Jacek Namieśnik
Część VII
Analiza ilościowa.
Katedra Chemii Analitycznej
Wydział Chemiczny
Politechnika Gdańska
2002
1
SPIS TREŚCI
Wprowadzenie
I. Co to jest chromatografia?
1.1. Proces chromatograficzny
1.2. Podział metod chromatograficznych
1.3. Co to jest chromatografia gazowa?
II. Terminy i definicje
2.1. Czas retencji (t
R
)
2.2. Współczynnik retencji (k)
2.3. Indeks retencji (I)
2.4. Współczynnik rozdzielenia
2.5. Teoretyczna liczba półek (N) lub sprawność kolumny
2.6. Rozdzielczość (R
S
)
2.7. Stosunek faz (β)
III. Kolumny kapilarne do chromatografii gazowej
3.1. Fazy stacjonarne
3.1.1. Polisiloksany
3.1.2. Glikole polietylenowe
IV. Gazy nośne
V. Dozowniki
5.1. Dozowniki wykorzystujące odparowanie
5.2. Dyskryminacja związków dozowanych
5.3. Opłukiwanie membrany
5.4. Dozowanie na kolumnę typu „
Megabore
”
5.5. Dozowniki z dzieleniem strumienia gazu (
split
)
5.6. Dozownik bez podziału strumienia gazu
VI. Detektory w GC
6.1. Detektor cieplno-przewodnościowy (TCD)
6.2. Detektor płomieniowo – jonizacyjny (FID)
6.3. Detektor wychwytu elektronów (ECD)
6.4. Detektor azotowo fosforowy (NPD)
6.5. Detektor płomieniowo – fotometryczny (FPD)
6.6. Detektor fotojonizacyjny (PID)
6.7. Spektrometr mas (MS)
VII. Analiza ilościowa
........................................................................................................VII/3
2
7. Analiza ilościowa
Termin „analiza ilościowa” ma różne znaczenie dla różnych analityków. Kiedyś, pojęcie to
definiowano jako względną lub procentową powierzchnię indywidualnych pików na
chromatogramie, których suma wynosiła 100%.
Analiza ilościowa była także definiowana jako metoda pozwalająca na stwierdzenie
obecności substancji na pewnym progowym poziomie (1 – 10). W rzeczywistości, analiza ta
pozwala określić dokładną ilość danego analitu w badanej próbce. Umożliwia oznaczenie
stężenia w częściach na milion (ppm), mg/ml, molach lub innych jednostkach pozwalających
określić ilość substancji (masy) w danej ilości oryginalnej próbki (lub objętości roztworu).
Wiele metod chromatograficznych stosowanych w analizach farmaceutycznych wymaga
określenia ilości analitu obecnego w gramach, w odniesieniu do wyjściowego składu ciała
stałego, lub w objętości, wyjściowego roztworu ciekłego. Stężenie nie oznacza udziału
procentowego lub powierzchni względnej; oznacza ono bezwzględną ilość lub masę w
odniesieniu na jednostkę objętości analitu zawartego w matrycy próbki.
Analityk nie może zaakceptować metody, bez dokładnego i precyzyjnego oszacowania
poziomu analitów obecnych w oryginalnej próbce. Przy określaniu ilości badanych analitów
stosuje się dokładnie określone wzorce oznaczanych analitów. Immuno-analiza jako metoda
alternatywna do oznaczania chromatograficznego, powinna także określać stężenie jako masę
na jednostkę objętości roztworu. Istota chemii analitycznej polega na dokładnym i
precyzyjnym oznaczeniu ilości składnika w analizowanej próbce.
Żadna z organizacji zainteresowanych analizami ilościowymi (np. organizacja „ The U.S.
Pharmacopeia” (USP), „The International Conference on Harmonization of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceoticals for Human Use” (ICH) oraz “Food and
Drug Administration”) nie podaje wytycznych co do wyboru konkretnej metody analizy
ilościowej. Zwykle analitycy muszą zastosować metodę prób i błędów aby wybrać najlepszą
metodę dla poszczególnego analitu analizowanej próbki.
Nie ma konkretnych zasad, szybkich reguł i wytycznych w analizie ilościowej z wyjątkiem,
aby końcowa wybrana metoda odznaczała się najlepszą możliwą dokładnością i precyzją,
najlepszą powtarzalnością i wysokim stopniem pośredniej precyzji i powtarzalności w
odniesieniu do różnych analityków, czasu wykonania i laboratoriów.
3
Wybrana metoda do ilościowego oznaczania powinna spełniać te cele w jak najkrótszym
czasie, przy minimalnym nakładzie pracy i jak najmniejszej ilości próbki użytej do analizy,
środków i czasu pracy aparatu. Generalnie, idealna analiza ilościowa będzie zależała od
poszczególnych badanych próbek, ich liczby, złożoności, możliwości automatyzacji oraz
dostępności próbki i wzorców.
CELE IDEALNEJ METODY ILOŚCIOWEJ
Idealna metoda ilościowa powinna posiadać następujące cechy i zalety:
1. Możliwość wykonania szybkiej analizy próbki przy minimalnym koszcie, pracy
manualnej, i wymogów aparatowych;
2. Wysoka precyzja i dokładność;
3. Niepodatność na interferencje zanieczyszczeń pochodzących od matrycy próbki i
odczynników analitycznych;
4. Eliminacjamożliwości utraty próbki i analitu podczas pracy lub analizy;
5. Możliwość zastosowania w rutynowych pracach prowadzonych przez odpowiednio
przygotowanych techników.
Ciągle pozostaje jednak istotne pytanie: którą z licznych metod ilościowych należy wybrać
dla danej próbki? Odpowiedź często zależy od rodzaju próbki, tj. czy jest to prosta mieszanina
z kilkoma pikami czy złożona z dużą ilością pików. Zazwyczaj, dla prostszych próbek (kilka
analitów, prosta matryca) stosuje się prostsze metody ilościowe i wykresy kalibracji uzyskane
dla wzorców zewnętrznych lub nawet kalibracyjne jednopunktowe.
Możliwość stosowania kalibracji jednopunktowej, kalibracji z zastosowaniem wzorców
zewnętrznych dla wielu próbek zazwyczaj prowadzi do zmniejszenia kosztów, skrócenia
czasu i pracochłonności a tym samym prowadzi do większej wydajności systemu. Jednakże
analityk może zastosować kalibrację jednopunktową i kalibrację dla wzorców zewnętrznych
tylko wtedy gdy stężenie wzorców, jest zbliżone do aktualnego stężenia nieznanej próbki w
liniowym zakresie metody. Bardziej złożone próbki płynów biologicznych zawierające liczne
anality, trudne do usunięcia składniki próbki o stężeniach na poziomie śladowym, wymagać
będą znacznie bardziej skomplikowanych metod ilościowych takich jak metoda dodatku
wzorca.
4
Oczywiście, analitycy nie mogą stosować technik ilościowych dopóki nie stwierdzą, że pik
pochodzący z określonej metody jest pojedynczym pikiem i że pochodzi z poprawnie
przeprowadzonej analizy. W przypadku HPLC, udowodnienie tego wymagać będzie
wyszukanych układów-fotodiod lub detekcji przy zastosowaniu spektrometru mas (MS) po
separacji metodą HPLC. Określenie jednoznaczności piku wymaga pomiaru widma UV i MS
dla każdego z analizowanych pików i zastosowania oprogramowania komputerowego w celu
nałożenia na siebie i porównania właściwości spektralnych (po znormalizowaniu lub
zastosowaniu wyszukanych algorytmów oprogramowania).
Obecnie, oprogramowanie umożliwia rutynowe przeprowadzenie takiego zadania podczas
obróbki danych, interpretacji jednorodności piku („czystości”). W takim oprogramowaniu
stosuje się zarówno układ-fotodiod jak i dane MS. Zapewnienie jednoznaczności w
odniesieniu tożsamości przy wykorzystaniu obu metod widmowych przed analizą ilościową
jest zalecanym podejściem.
Innym stałym elementem oprogramowania jest zastosowanie plików w bibliotekach, które
mogą być wykorzystane przy dopasowaniu w celu potwierdzenia spodziewanej lub
domniemanej struktury analizowanego piku. Nie ma sensu przeprowadzania analizy
ilościowej bez znajomości tożsamości i jednorodności, bo mogłoby to doprowadzić do
otrzymania niepoprawnych wyników.
Metoda wzorca zewnętrznego (kalibracji zewnętrznej)
W metodzie wzorca zewnętrznego, analityk musi sporządzić wykres kalibracyjny (rysunek 1)
wykorzystując znane stężenia pojedynczych wzorców, najlepiej w rozpuszczalniku
zastosowanym w aktualnej próbce. Pomiary należy wykonać dla co najmniej pięciu stężeń,
dla każdego trzy razy (n=3), i, najlepiej jeżeli każde ze stężeń będzie przygotowane
oddzielnie a nie przez rozcieńczenie pojedynczego roztworu o wysokim stężeniu. Takie
podejście ujawni błąd, który może powstać podczas przygotowania wszystkich roztworów
wzorcowych, nie zaś błąd spowodowany błędami w rozcieńczeniu.
5
[ Pobierz całość w formacie PDF ]